PCR定量試劑盒的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度的變化來對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。
PCR熒光定量是一種非常敏感的檢測(cè)方法，但是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常開展檢測(cè)工作，一旦實(shí)驗(yàn)室管理和環(huán)境控制沒有執(zhí)行到位，就存在由于交叉污染出導(dǎo)致假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。
PCR定量試劑盒檢測(cè)出現(xiàn)假陽性的常見原因：
1、實(shí)驗(yàn)室污染是導(dǎo)致假陽性結(jié)果
實(shí)驗(yàn)室如果長期檢測(cè)陽性樣本，擴(kuò)增產(chǎn)物中高濃度的目的片段很容易擴(kuò)散到空氣中并不斷累積導(dǎo)致氣溶膠污染。
2、熒光定量PCR儀性能不佳導(dǎo)致翹尾
某些熒光定量PCR儀性能不佳，在反應(yīng)后期出現(xiàn)非特異性翹尾峰。
3、電壓不穩(wěn)導(dǎo)致的基線不穩(wěn)定
電壓不穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增基線不穩(wěn)定。另外，臨床實(shí)驗(yàn)室停電風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。建議這些實(shí)驗(yàn)室配備UPS緊急電源。
4、樣本或者氣泡干擾
反應(yīng)體系中存在氣泡或者某些樣本含有特殊成分可能干擾實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增曲線，這種擴(kuò)增曲線通常不呈現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線形態(tài)。
5、定量試劑盒污染或者非特異性反應(yīng)
某些試劑盒沒有在GMP車間進(jìn)行生產(chǎn)，或者GMP車間生產(chǎn)過程中車間潔凈度不夠或人員操作不規(guī)范，在試劑盒生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)陽性核酸片段或者質(zhì)粒污染反應(yīng)體系的情況。
某些PCR定量試劑盒的生產(chǎn)工藝不過關(guān)，可能出現(xiàn)非特異性翹尾現(xiàn)象。試劑盒中引物、探針等原料品質(zhì)不過關(guān)，質(zhì)量控制不嚴(yán)格，也可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。
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