植物根系活力檢測(cè)試劑盒（TTC法）說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5275

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一支試劑一B加入一瓶試劑一A中，加入30mL試劑二溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。配制好后置于2-8℃，一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。

2、 試劑二：若試劑有結(jié)晶析出，可40℃加熱或者超聲溶解。

3、 試劑四：乙酸乙酯，自備。提供一125mL 空瓶。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1mL試劑二，充分震蕩混勻, 即10mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)液。2-8℃可以保存1周，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

根系是植物吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的主要器官，同時(shí)又是植物體中重要物質(zhì)如氨基酸、激素等物質(zhì)合成、同化、轉(zhuǎn)化的器官，因此根的生長(zhǎng)情況和活動(dòng)能力直接影響植物個(gè)體的生長(zhǎng)情況、營(yíng)養(yǎng)水平和產(chǎn)量水平等，根系活力具有重要的實(shí)際意義。

TTC可被氫還原成不溶性的紅色三苯基甲臜（TTF），TTF在485nm處有吸收峰。當(dāng)TTC溶液滲入到植物根部組織時(shí)，呼吸過(guò)程產(chǎn)生的還原物質(zhì)可將其還原成TTF(紅色)，植物根部組織被染成紅色。根系活力強(qiáng)弱可用TTC的還原量來(lái)表示。此方法檢測(cè)的根系活力即植物根系的脫氫酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))、研缽/勻漿器、乙酸乙酯，冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

樣本的制備：將根部組織洗凈，去除根上的泥土，輕輕擦干，不要過(guò)分?jǐn)D壓破壞根系細(xì)胞。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至485nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用乙酸乙酯調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋?zhuān)?/span>

（1） 臨用前取10μL 10mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)液，加入1990μL試劑二，充分混勻，配制成50μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。（后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要1000μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積。）

（2） 取1mL 50 μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一支試劑三內(nèi)，充分震蕩混勻2min?；靹蚝蠹尤?/span>1mL乙酸乙酯，再次充分震蕩混勻2min，室溫靜置分層5min，取上層溶液。

（3） 將上層溶液用乙酸乙酯進(jìn)行稀釋?zhuān)玫?/span>20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用（吸取200μL 50 μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可）。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定

取200μL 20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))中，分別測(cè)定其在485nm處的吸光度。計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}。ΔA標(biāo)準(zhǔn)只需做1-2次。

4、在2mL EP管按下表步驟加樣：

充分研磨（建議在通風(fēng)櫥操作）后全部移至于離心管中，12000 rpm，4℃，離心 10min，取 200μL 上清至微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))中，測(cè)定 485nm下的吸光值。計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)只需做1-2次，每一個(gè)測(cè)定管對(duì)應(yīng)一個(gè)對(duì)照管）。ΔA測(cè)定的測(cè)定范圍在0.005-1.5之間。

三、根系活力計(jì)算

按照樣本質(zhì)量計(jì)算根系活力：以TTC的還原量來(lái)表示根系活力

TTC還原強(qiáng)度 [ μg TTC/(g·h) ] =ΔA測(cè)定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V÷ (W×T)=5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

W：根重，g；C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，20μg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，4h；V：試劑四的體積即勻漿體積，1mL。

注意事項(xiàng)：

1、 試劑四容易揮發(fā)，有毒，為了您的健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，戴口罩，戴乳膠手套操作。

2、 若樣品37℃暗反應(yīng)未到4h但根系已出現(xiàn)深粉色，此時(shí)可以直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作；若ΔA測(cè)定大于1.5，可以減少樣本質(zhì)量或者縮短反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算公式注意修改。

3、 若4h暗反應(yīng)結(jié)束后，根系沒(méi)有出現(xiàn)粉色或者ΔA測(cè)定小于0.005，可以延長(zhǎng)暗反應(yīng)時(shí)間（8h，16h甚至24h）或者加大樣品量，計(jì)算公式注意修改。

4、 如果離心后待測(cè)的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長(zhǎng)時(shí)間，例如15000rpm 4℃離心20min。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱(chēng)取0.131g蔥的根部，洗凈，擦干，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質(zhì)）測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.714-0.082=0.632，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計(jì)算：

TTC還原強(qiáng)度=5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =39.033 μg TTC/(g·h)

2、 稱(chēng)取0.126g景天的根部，洗凈，擦干，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質(zhì)）測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.422-0.139=0.283，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計(jì)算：

TTC還原強(qiáng)度=5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =18.172 μg TTC/(g·h)

3、 稱(chēng)取0.118g蒜的根部，洗凈，擦干，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板（非聚苯乙烯材質(zhì)）測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.191-0.055=0.136，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，帶入公式計(jì)算：

TTC還原強(qiáng)度=5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =9.325 μg TTC/(g·h)

參考文獻(xiàn)：

[1] Xiuyun Zhu, Meng Liang,Yu Ma. A Review Report on the Experiments for the Determination of Root Activity by TTC Method[J]. Guangdong Chemical Industry, 2020

[1] Sangen Wang. Plant Physiology Experiment Course[M]. Science Press, 2005.

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